Kategoria: Biostatystyka

Opracowanie analiz statystycznych i profili genetycznych odmian lilaków (Syringa sp.) naturalnie występujących i hodowanych w Polsce oraz atrakcyjnych okazów o nieznanym pochodzeniu metodą RAPD-PCR. Zgromadzenie banku komórek kalusowych.

 

Wstęp:

Projekt dotyczy opracowania statystycznego lilaków (Syrynga sp.) i obejmować będzie trzy części. Pierwsza to opracowanie statystyk i  profili genetycznych stu odmian bzów lilaków popularnie hodowanych i naturalnie występujących na terenie Polski i środkowo- wschodniej części Europy. Do zgromadzenia informacji jakie są to odmiany i gdzie występują posłużymy się wiedzą historyczną [1] oraz informacjami zawartymi w polskich publikacjach naukowych dotyczących flory Polski oraz jej poszczególnych rejonów i Europy, ze zwróceniem szczególnej uwagi na jej centralno-wschodnią część. Składać się będzie docelowo z kolekcji poszczególnych Parków Narodowych, ogrodów botanicznych i innych obszarów chronionych oraz reszty kraju. Badanie wykonane zostanie z zastosowaniem metody RAPD-PCR  [2], na której to opierają się prawie wszystkie analizy statystyczne markerów molekularnych. Zastosowane zostaną metody i startery w oparciu o pracę przeprowadzoną przez E. Z. Kochieva w 2004 roku [3], które to przeprowadzone były na 22 lilakach, w tym 6 gatunków, 1 hybryda, i 15 odmian. Zidentyfikowano wtedy 512 polimorficznych fragmentów zarówno gatunkowo-specyficznych jak i specyficznych dla odmian. Były to w przypadku tego gatunku pierwsze badania analizujące polimorfizm genomu jądrowego.

Wyniki badań tego etapu będą podstawą dla drugiej części projektu , którą jest opracowanie statystyczne profilów genetycznych krzewów o nieznanym pochodzeniu, a następnie porównanie ich do otrzymanych profili znanych odmian. Materiał roślinny do tej części badań zbierany będzie z zamieszkałych bądź opuszczonych wiejskich terenów Warmii i Mazur. Pod uwagę brane będą szczególnie stare i okazałe krzewy, o ciekawym i bujnym ulistnieniu, ukwieceniu, barwie, zapachu, wysokości i kształcie korony. Efekt tego porównania może być dwojaki dla poszczególnych badanych krzewów. Być może będzie to odkrycie zapomnianej odmiany, bądź w najlepszym wypadku, nowej, nie znanej wcześniej, atrakcyjnej gospodarczo i w ogrodnictwie, odpornej na warunki pogodowe. Będziemy tez w stanie zdefiniować idealne warunki hodowlane dla tych krzewów w oparciu o rozpoznanie warunków mikroklimatycznych i glebowych, w których znalezione zostały okazy. Warmia i Mazury są terenem o wyjątkowo wysokim zagęszczeniu tych roślin, jest to podstawowy i wystarczający powód dla zbierana stamtąd materiału roślinnego.

Trzecią częścią będzie zgromadzenie komórek kalusowych wszystkich przebadanych odmian lilaka w postaci banku w parach ciekłego azotu. Utworzenie bazy profili genetycznych jest dobrą podstawą dla ochrony i rozwoju tego gatunku, jednak dodatkowe stworzenie banku komórek tej rośliny jest szczytową formą dla tego celu. Wiele Parków i ogrodów botanicznych może poszczycić się bogactwem i różnorodnością gromadzonych roślin, jednak to banki zawsze były zabezpieczeniem dla przyszłości gatunków czy to świata roślinnego, czy zwierzęcego. W przypadku gatunku Syringa, projekt ten będzie pierwszą tego typu inicjatywą. W jednym miejscu, małym kosztem zgromadzony zostanie materiał wystarczający do rozwoju rośliny, bez potrzeby znajdowania kawałka gruntu, sadzenia i hodowli rośliny.

 

Aktualny stan wiedzy i analiza statystyczna danych:

Lilaki to jedne z najpopularniejszych liściastych krzewów ozdobnych hodowanych na terenie klimatu umiarkowanego wschodniej Europy, Azji oraz Ameryki północnej [4]. Przeciętnie osiągają do około 3 metrów wysokości, maksymalnie do 5 metrów. Silnie się rozgałęzia. Ozdobą rośliny są okazałe wiechowate kwiatostany długości około 15cm w kolorach od białego przez fioletowe, różowe, niebieskie do ciemnofioletowych, purpurowych. Kwiaty mogą być pojedyncze  lub pełne. Są to silnie i przyjemnie pachnące rośliny. Liście sercowate, ciemnozielone. Kwitną w maju. Są to bardzo atrakcyjne krzewy hodowlane nie tylko ze względu na swój atrakcyjny wygląd i zapach ale również łatwość hodowli bez specjalnych wymagań, są bardzo wytrzymałe na mrozy i suszę. Niewybredna co do warunków glebowych, ubogich i średnio wilgotnych.

Około 22-30 jego gatunków (w zależności od różnych klasyfikacji) zostało rozpoznanych i rozpowszechnionych w ogrodnictwie. Badania wykazały, że rodzaj Syringa należy do rodziny Oleoideae (oliwkowate) [5]. Rodzaj ten dzieli się na dwa podrodzaje: Ligustrina oraz Syringa, z czego pierwszy zawiera tylko dwa gatunki: S. reticulata i S. pekinensis [6], drugi natomiast, na podstawie analizy statystyk i kompozycji flawonoidów, dzieli się na cztery serie: Syringa, Villosae, Pubescentes, Pinnatifoliae [7,8] (chociaż niektórzy autorzy łączą ze sobą serie: Syringa i Pinnatifoliae w jedną, na podstawie molekularnej analizy  chloroplastowego DNA i analizy statystyczne sekwencji spacerowych genów rybosomalnych, a ich krzyżówki dają płodne potomstwo [9,10]), a dopiero te na gatunki. Znanych jest również ponad 2000 odmian. Tylko dwa gatunki dziko pojawiają się w Europie: S. vulgaris and S. josikaea [11], a pozostałe w Azji [12].

Badanie wykonane zostanie z zastosowaniem metody RAPD-PCR [2], na której to opierają się prawie wszystkie biostatystyki  markerów molekularnych. Poznanie struktury genetycznej organizmów na poziomie molekularnym DNA jest kluczową informacją, jaka może być wykorzystana w rozpoznaniu różnorodności genetyczne Syrynga oraz umożliwia selekcję osobników najbardziej odpornych na zmienne warunki środowiska oraz szkodliwe czynniki biotyczne i abiotyczne. Ustalanie tożsamości genetycznej materiału biologicznego i określenie jego filogenezy opiera się na badaniu wybranych fragmentów DNA, przy użyciu markerów genetycznych [14]. Ogólnie, wyróżnia się trzy grupy markerów: 1. markery morfologiczne, 2. markery biochemiczne (izoenzymy, fenole, terpeny), 3. markery molekularne na poziomie DNA (w DNA jądrowym, mitochondrialnym i chloroplastowym). Marker genetyczny to te fragmenty DNA (wielkości od kilkudziesięciu do kilkuset par zasad), które wykazują zmienność strukturalną w obrębie danego loci i umożliwiają identyfikację genotypu danego organizmu. Powszechnie przyjmuje się, że markery genetyczne powinny się charakteryzować przede wszystkim dużym polimorfizmem, wysoką częstotliwością występowania i równomiernym rozłożeniem w genomie. Dobry marker powinien wykazywać neutralność selekcyjną (czyli brak sprzężenia z genami plejotropowymi) oraz niezależność ekspresji pod wpływem czynników zewnętrznych. Ponadto, marker genetyczny powinien być wykrywalny.

Opracowana statystycznie przez Williams [15] oraz Welsh i McClelland w 1990 roku [16] technika RAPD jest odmiana metody PCR i umożliwia równoczesną detekcję polimorfizmu wielu loci w całym genomie. Metoda ta polega na stosowaniu jednego startera o losowo dobranej sekwencji (o długości ok. 9–10 par zasad), generując różnej wielkości fragmenty. Zaletą markerów RAPD jest mała wymagana ilość DNA wyjściowego i łatwość w wykonaniu analiz statystycznych . Powtarzalność biostatystyk przy RAPD między laboratoriami jest różnie oceniana, ale generalnie dość wysoka, nawet do 93%, dodatkowo łatwość wykonania techniki i względnie tani koszt analiz statystycznych, sprawiają, że markery RAPD są powszechnie stosowanie w badaniu zróżnicowania DNA jądrowego między osobnikami i populacjami danego gatunku, umożliwiają ponadto identyfikację osobników pochodzących z klonów oraz genotypowanie rzadkich endemicznych populacji. Rodzaj materiału roślinnego pobranego do analiz nie wpływa na uzyskane wyniki, nie wykryto różnic pomiędzy profilem RAPD dla DNA pochodzącego z pędów położonych na różnej wysokości jednej gałęzi, z pąków śpiących czy pędów wyhodowanych in vitro [17]. Aby szczegółowo określić zmienność genetyczną na podstawie markerów RAPD zaleca się pobranie DNA z ok. 30–100 osobników z populacji oraz stosowanie wielu starterów tak, aby z jak największym prawdopodobieństwem zidentyfikować różnice, co w przypadku tego projektu będzie ułatwione, gdyż zadanie to zostało wykonane przez wcześniej wspomnianego E. Z. Kochieva w 2004 roku.

Do tej pory jeszcze nikt w Polsce nie podjął się zgromadzenia bazy profili genetycznych lilaków. Jedyne badania o tym charakterze obejmują małe grupy roślin obejmujące pojedyncze ogrody botaniczne, w celach raczej poznawczych i orientacyjnego rozpoznania możliwości różnych metod zarówno dla DNA genomowego, jak i chloroplastowego [3, 13]. Wspomniane wcześniej badania E. Z. Kochieva z 2004 roku [3] pozwoliły na znalezienie unikalnego wzoru dla wszystkich badanych odmian, badania te będą podstawa dla identyfikacji odmian w tym badaniu.

Stworzenie banku komórek tej rośliny jest najlepsza forma dla zachowania i zabezpieczenia i po prostu zebrania wszystkich odmian np. w celu późniejszych analiz i obliczeń statystycznych , i ewentualnych manipulacji genetycznych. W przypadku gdyby projekt wykazał odkrycie nowej, zapomnianej bądź też wymierającej odmiany, metoda ta pozwoliłaby na jej późniejszą mikropropagację. Wiele Parków i ogrodów botanicznych może poszczycić się bogactwem i różnorodnością gromadzonych roślin, jednak to banki zawsze były zabezpieczeniem dla przyszłości gatunków czy to świata roślinnego, czy zwierzęcego. W przypadku gatunku Syringa, projekt ten będzie pierwszą tego typu inicjatywą. W jednym miejscu, małym kosztem zgromadzony zostanie materiał wystarczający do rozwoju rośliny, bez potrzeby znajdowania kawałka gruntu, sadzenia i hodowli rośliny. Kriokonserwacja jest metodą przechowywania materiału genetycznego w stanie głębokiego zamrożenia tj. w oparach ciekłego azotu (-150 C) lub w ciekłym azocie (-196 C) dzięki czemu komórki przez wiele lat nie tracą żywotności.

 

Metodyka i narzędzia, zadania:

• pierwsza część: określenie profilu genetycznego znanych odmian lilaka:

1. Zbiór materiału

Pierwszym etapem w badaniu będzie pozyskiwanie materiału roślinnego do analiz biostatystyki i danych. Tkanki pobierane będą od osobników zdrowych (bez symptomów chorobowych) i zbliżonych wiekiem  [14]. Zebrany materiał roślinny (pąki, liście) na czas transportu przechowywany będzie w falkonach w suchych warunkach i w temperaturze poniżej 0 °C. Materiał zbierany będzie z ogrodów botanicznych, parków narodowych i naukowych w Polsce i sklepów ogrodniczych.

2. ekstrakcja DNA

Wstępna liza ścian komórkowych poprzez homogenizację mechaniczną przez rozcieranie materiału w moździerzu w ciekłym azocie w celu ułatwienia właściwej ekstrakcji kwasów nukleinowych z tkanek roślinnych [18,19]. Zastosowany zostanie zestaw do izolacji DNA, (Dneasy Plant Mini Kit lub podobne) [18]. Zaletą tego zestawu jest duża wydajność i czystość otrzymanych ekstraktów DNA, wolnych od takich komponentów komórkowych, jak np. obecne w komórkach roślinnych polisacharydy, które mogą hamować działanie polimerazy w reakcji PCR [20]. do ekstrakcji DNA użyte zostanie około 100mg liści, z zastosowaniem Rnazy A (10 mg· ml–1). Wydajność ekstrakcji DNA będzie następnie badana spektrofotometryczne. Wyekstrahowane cząsteczki DNA mogą być następnie przechowywane w buforze stabilizującym (pH 7,0) w temperaturze –75 °C [19]. Takie magazynowanie może trwać nawet kilka lat.

3. Reakcja RAPD-PCR

Stężenie DNA matrycowego zrównoważone będzie do 29ng na 1ul roztworu (GeneQuant DNA/RNA Calculator – Pharmacia LKB lub podobne). Reakcja PCR przeprowadzona będzie z zastosowaniem serii starterów OPD5. Mix PCR dla 25ul: 1.5 mM MgCl2,100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.1% Triton X-100, 0.2 μM primer, 0.2 mM każdego z dNTP, 1.0 jednostki polimerazy DNA Taq (Fermentas MBI) i 50 ng matrycowego DNA. Amplifikacja DNA z zastosowaniem termocyklera z zastosowaniem programu: wstępna denaturacja: 94C\7min, 40 razy cykl w 94C\30s, denaturacja przez 50s, 2min\72C, ostatecznie wydłużanie 72C\7min. Temperatura denaturacji odpowiednia do Tm starterów. Produkty amplifikacji będą następnie barwione w 6x Orange Loading dye Solution. Amplifikowane w reakcji PCR fragmenty DNA są następnie rozdzielane przy zastosowaniu elektroforezy w 2% żelu agarozowym pod napięciem 80V\2h. 1xTBE w temp. Pokojowej. Jako marker molekularny masy zastosowany zostanie O’RangeRuler 200bp DNA Ladder (Fermentas lub podobne). Jako kontrola negatywna wykorzystana zostanie woda zamiast matrycowego DNA. Wizualizacja wyników elektroforezy z bromkiem etydyny (0.5 mg · ml–1) pod transiluminatorem UV, a następnie fotografowanie żelu (Polaroid DS-34 lub podobne).

4. zgromadzenie danych do analizy statystycznej

Dane profili genetycznych w postaci zdjęć zostaną zarchiwizowane w postaci elektronicznej w celu późniejszych analiz biostatystycznych , wraz z opisem morfologii rośliny, pełną nazwą łacińska, gatunku i odmiany.

 

• druga część: określenie profilu genetycznego lilaków zebranych z terenów Warmii i Mazur.

1′. Materiał roślinny do tej części badań zbierany będzie z zamieszkałych bądź opuszczonych wiejskich terenów Warmii i Mazur. Pod uwagę brane będą szczególnie stare i okazałe krzewy, o ciekawym i bujnym ulistnieniu, ukwieceniu, barwie, zapachu, wysokości i kształcie korony. Wykonane zostanie rozeznanie w formie telefonicznej np. do leśniczówek, szkółek leśnych, sołtysów i mieszkańców wsi.

etapy 2′ i 3′ podobnie jak w pierwszej części badania.

4′. Analiza statystycznych wyników i zgromadzenie danych

Profile uzyskane w tej części badania porównane zostaną do tych należących do znanych odmian. W przypadku znalezienia podobieństwa, będzie to oznaczać możliwość określenia pochodzenia rośliny, w przypadku jego braku- odkrycie nowej odmiany, bądź nieanalizowanej statystycznie wcześniej, ale znanej.

• Trzecia część: Zgromadzenie banku komórek kalusowych badanych roślin.

5. Indukcja kalusa. Przygotowanie materiału roślinnego wszystkich badanych roślin w postaci liści i sterylizacja poprzez płukanie tkanki w roztworze detergentu zmniejszającego napięcie powierzchniowe (np. roztwór płynu do mycia naczyń) przez 15 min. następnie moczenie w 5% roztworze podchlorynu i 3min. i w 70% etanolu. Opłukanie tkanki trzykrotnie w jałowej wodzie destylowanej. Transfer tkanki na pożywkę indukującą powstawanie kalusa. Każdy eksplantat został wprowadzony do probówki z 15ml pożywki NDN (New Dogashima Medium) składającej się z 0.5mM NAA, 4.4 mM BA, 29,2 mM sacharozy z dodatkiem agaru w ilości 2 g/ L. Przy ustalonym pH do 5.4 przed nielawowaniem przez 15 min w 120 C. Kultury inkubowane będą w w probówkach zasłoniętych folia aluminiową i inkubowane w 23 C w 14 godzinnym rytmem oświetlenia. Co miesiąc kultury przenoszone będą do świeżej pożywki. Po 7 miesiącach otrzymane zostaną kultury kalusowe. 200mg komórek kalusowych zostanie przeniesionych do 100ml kolb erlenmajerek zawierających 40ml płynnej pożywki (skład jak wyżej) z wytrząsaniem w 80 rpm w 23 C przy 14 godzinnym trybie oświetlenia.
6. krioprezerwacja
7. przechowywanie materiału- Archiwizacja i magazynowanie komorek

naturalnie występujących i hodowanych w Polsce oraz atrakcyjnych okazów o nieznanym pochodzeniu metodą RAPD-PCR. Zgromadzenie banku komórek kalusowych.

 

Wstęp:

Projekt dotyczy lilaków (Syrynga sp.) i obejmować będzie trzy części. Pierwsza to opracowanie statystyczne profili genetycznych stu odmian bzów lilaków popularnie hodowanych i naturalnie występujących na terenie Polski i środkowo- wschodniej części Europy. Do zgromadzenia informacji jakie są to odmiany i gdzie występują posłużymy się wiedzą historyczną [1] oraz informacjami zawartymi w polskich publikacjach naukowych dotyczących flory Polski oraz jej poszczególnych rejonów i Europy, ze zwróceniem szczególnej uwagi na jej centralno-wschodnią część. Składać się będzie docelowo z kolekcji poszczególnych Parków Narodowych, ogrodów botanicznych i innych obszarów chronionych oraz reszty kraju. Badanie wykonane zostanie z zastosowaniem metody RAPD-PCR  [2], na której to opierają się prawie wszystkie analizy biostatystyczne markerów molekularnych. Zastosowane zostaną metody i startery w oparciu o pracę przeprowadzoną przez E. Z. Kochieva w 2004 roku [3], które to przeprowadzone były na 22 lilakach, w tym 6 gatunków, 1 hybryda, i 15 odmian. Zidentyfikowano wtedy 512 polimorficznych fragmentów zarówno gatunkowo-specyficznych jak i specyficznych dla odmian. Były to w przypadku tego gatunku pierwsze badania analizujące polimorfizm genomu jądrowego.

Wyniki badań tego etapu będą podstawą dla drugiej części projektu , którą jest opracowanie statystyczne  profilów genetycznych krzewów o nieznanym pochodzeniu, a następnie porównanie ich do otrzymanych profili znanych odmian. Materiał roślinny do tej części badań zbierany będzie z zamieszkałych bądź opuszczonych wiejskich terenów Warmii i Mazur. Pod uwagę brane będą szczególnie stare i okazałe krzewy, o ciekawym i bujnym ulistnieniu, ukwieceniu, barwie, zapachu, wysokości i kształcie korony. Efekt tego porównania może być dwojaki dla poszczególnych badanych krzewów. Być może będzie to odkrycie zapomnianej odmiany, bądź w najlepszym wypadku, nowej, nie znanej wcześniej, atrakcyjnej gospodarczo i w ogrodnictwie, odpornej na warunki pogodowe. Będziemy tez w stanie zdefiniować idealne warunki hodowlane dla tych krzewów w oparciu o rozpoznanie warunków mikroklimatycznych i glebowych, w których znalezione zostały okazy. Warmia i Mazury są terenem o wyjątkowo wysokim zagęszczeniu tych roślin, jest to podstawowy i wystarczający powód dla zbierana stamtąd materiału roślinnego.

Trzecią częścią będzie zgromadzenie komórek kalusowych wszystkich przebadanych odmian lilaka w postaci banku w parach ciekłego azotu. Utworzenie bazy profili genetycznych jest dobrą podstawą dla ochrony i rozwoju tego gatunku, jednak dodatkowe stworzenie banku komórek tej rośliny jest szczytową formą dla tego celu. Wiele Parków i ogrodów botanicznych może poszczycić się bogactwem i różnorodnością gromadzonych roślin, jednak to banki zawsze były zabezpieczeniem dla przyszłości gatunków czy to świata roślinnego, czy zwierzęcego. W przypadku gatunku Syringa, projekt ten będzie pierwszą tego typu inicjatywą. W jednym miejscu, małym kosztem zgromadzony zostanie materiał wystarczający do rozwoju rośliny, bez potrzeby znajdowania kawałka gruntu, sadzenia i hodowli rośliny.